研究人员表示，尽管CBE可以在目标基因座上实现有效的胞嘧啶到胸嘧啶（C-T）而没有双链断裂，但目前的CBE在其活动窗口内编辑了所有C，产生不希望的旁观者突变。当旁观者C与目标C相邻时，现有的基本编辑器将同时编辑两个C。

  为了提高CBE的精度，研究人员将人APOBEC3G（A3G）脱氨酶工程化为三个变体，并将其与Cas9切口酶融合。所得的A3G-BE在人类细胞中的5'-CC-3'基序中表现出对第二个C的选择性编辑，以高精度安装与单一疾病相关的C-T取代。

  脊椎动物中的各种脱氨基酶（APOBEC酶）通过将病毒互补DNA中的C取代为U，来介导防御逆转录病毒或逆转座子的感染，这表明这些胞嘧啶脱氨酶对于特定的序列基序可能具有独特的偏好，以区分DNA序列与天然宿主。研究人员发现，人类APOBEC3G（A3G）是在多个C环境中开发序列特异性BE的候选者。他们对A3G-BE变体进行了表征和工程改造，以有效地编辑HEK293T细胞内源性位点上的单个C，*终得到三个新颖的变体：A3G-BE4.4，A3G-BE5.13和A3G-BE5.14。它们在CC基元背景下表现出较高的编辑效率和精度。

  进一步的分析表明，尽管在研究人员测试的所有位点上，A3G-BE4.4，A3G-BE5.13和A3G-BE5.14都选择性地编辑了CC基序中的第二个C，但A3G-BE4.4显示出对比其他两个变体更窄的编辑窗口。进一步的测试显示，这三个变体都具有一致且广泛的基础编辑活动窗口，但是它们的主要编辑效率有所不同——A3G-BE5.13*有效，其次是A3G-BE5.14和A3G-BE4.4。

  为了在与疾病相关的背景下测试A3G-BE，他们试图精确生成已报道的人类致病性疾病的SNP。研究人员选择了三种由C-T取代引起的遗传变异，其中野生型序列位于A3G-BEs的优先5'-CC-3'基序内，包括囊性纤维化，高渗性肌病和运甲状腺素蛋白淀粉样变性。他们构建了针对这些疾病相关位点的单个sgRNA，并将它们与BE4max，A3G-BE4.4，A3G-BE5.13和A3G-BE5.14共转染到HEK293T细胞中。

  将修改的等位基因频率与BE4max进行直接比较，结果表明，在所有三个模型中，A3G-BEs诱导的完全修饰等位基因的比例要高得多，而A3G-BE5.13在高渗性肌病中获得了*高比例的完全修饰等位基因（36％）。对于运甲状腺素蛋白淀粉样变性，所有A3G-BEs都能高效产生所需的等位基因（超过35％），而BE4max则无法编辑靶标C，因为它无法在其活性范围之外进行编辑。与BE4max相比，A3G-BE5.14完成了运甲状腺素蛋白淀粉样变性正确模型的613倍。同样，对于囊性纤维化，所有A3G-BEs均诱导超过50％的完美修饰等位基因，而BE4max平均为0.6％。

  研究人员还着手研究A3G-BE的治疗适用性。他们选择了三种由T> C突变引起的人类致病性SNP，它们可以优先被A3G-BE靶向，包括遗传性焦磷酸细胞增多，囊性纤维化和全羧化酶合成酶缺乏症。他们产生了三个HEK293T细胞系，每个细胞系包含200个碱基对，每个疾病相关序列均已整合到基因组中，并共编码了靶向疾病相关位点的BE和sgRNA。

  他们的分析表明，在纠正遗传性焦磷酸细胞增多症和囊性纤维化方面，所有A3G-BEs的表现均比BE4max至少高出三倍。此外，在其他Bes中，A3G-BE4.4单独诱导了超过50％的完全校正等位基因，并且在整体羧化酶合成酶缺乏症方面，校正量比比BE4max高出6,496倍。

  资深作者，莱斯大学生物分子工程师薛高在一份声明中说：“我们鉴定了540种人类病原体单核苷酸多态性，可以通过我们的A3G-BEs精确校正。它们似乎还减少了DNA和RNA水平的脱靶编辑。人类有30亿个碱基对，我相信这项技术的精确水平将对治疗遗传疾病做出重要贡献。”

  参考：

  https://www.genomeweb.com/gene-silencinggene-editing/improved-cytosine-base-editing-tech-eliminates-problem-undesired